ELISA試劑盒操縱規(guī)則（新手適用）

ELISA試劑盒操縱規(guī)則（新手適用）
 
    一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />     酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù),ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原),天生抗原(抗體)--待測(cè)抗體(抗原)--酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)天生有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。待測(cè)抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)天生正比。
 
 
    二．實(shí)驗(yàn)原理
    用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立即測(cè)定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法正確地定量。
     辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個(gè)分子含有一個(gè)氯化血紅素(protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的zui大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的zui大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計(jì)算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計(jì)算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP純度(RZ)=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，zui高可達(dá)3.4。用于ELISA檢測(cè)的HRP的RZ值要求在3.0以上。
 
   ELISA的基本原理有三條： 
    （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
    （2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； 
    （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加進(jìn)底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。
    ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，以為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操縱等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面： 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
 
基本方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過一夜。越日，棄往孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空缺孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加進(jìn)新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。 
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加進(jìn)臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加進(jìn)2M硫酸0.05ml。 
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空缺對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
 
基本方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法： 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過一夜。越日洗滌3次。 
↓ 
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空缺、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 
↓ 
于反應(yīng)孔中，加進(jìn)新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。 
↓ 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
 
     （二） 酶與底物
    酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。
免疫技術(shù)常用的酶及其底物
 

 
     *  終止劑為2mol/L H2SO4
     ** 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。
     可催化下列反應(yīng)： HRP+H2O2→復(fù)合物 復(fù)合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 --為無色底物, 供氫體； A-- 為有色產(chǎn)物。
 
（三） ELISA常用的四種方法
 
    1．直接法測(cè)定抗原
      將抗原吸附在載體表面；
      加酶標(biāo)抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物；
      加底物。底物的降解量＝抗原量。
 
     2．間接法測(cè)定抗體
     將抗原吸附于固相載體表面；
      加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物；
      加酶標(biāo)抗體；
      加底物。 測(cè)定底物的降解量＝抗體量。
 
    3．雙抗體夾心法測(cè)定抗原
     將抗原免疫*種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;
     加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;
     加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;
     加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗體的抗體);
     加底物。底物的降解量＝抗原量。
 
    4. 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原
    將抗體吸附在固相載體表面;
     (1) 加進(jìn)酶標(biāo)抗原；
     (2),(3)加進(jìn)酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原；
     加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
 
    三．儀器和材料
 
    1. 聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板(平板, 40, 96孔)。
    2. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀
    3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。
    4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。
     5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween-20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。
     6. 洗滌液：同稀釋液
     7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS。
     8. 鄰苯二胺溶液(底物)：臨用前配制 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40 微升。
     9. 終止液：2mol/LH2SO4。
 
    四.  操縱步驟
    1. 包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋, 一般為1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃溫育1小時(shí)后，4℃冰箱放置16～18小時(shí)。
    2. 洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，zui后將反應(yīng)板顛倒在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
   3. 加封閉液200微升，37℃放置一小時(shí)。
   4. 洗滌同2。
   5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,，每孔200微升。同時(shí)作稀釋液對(duì)照。37℃放置2小時(shí)。
   6. 洗滌同2。
   7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時(shí)。
   8. 洗滌同2。
   9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10--15分鐘。
   10. 加終止液：每孔50微升。
   11. 觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄450nm讀數(shù)。